本試劑僅供研究使用

試驗原理：
試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知AGEs濃度的標準品旦部、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將和生物素標記的抗體同時溫育较店。洗滌后士八，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌梁呈，去除未結合的酶結合物婚度，然后加入底物A、B官卡，和酶結合物同時作用蝗茁。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中濃度呈比例關系剥乍。

試劑盒內容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標板 1塊板(96T) 半塊板(48T) 即用型
塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型
標準品：800ng/ml 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按說明書進行稀稀
空白對照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型
標準品稀釋緩沖液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型
生物素標記的抗AGEs抗體 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型
洗滌緩沖液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml) 按說明書進行稀釋
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
標本稀釋液 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml) 即用型

自備材料
1． 蒸餾水泊术。
2． 加樣器：5ul候赏、10ul、50ul沃菩、100ul盯媚、200、500ul伐薯、1000ul弥禀。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等匣诉。

安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A诡岂、B。一旦接觸到這些液體曾瞪，請盡快用水沖洗登鄙。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品掰儿。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份骤公。

操作注意事項
1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫扬跋。稀稀過后的標準品應丟棄阶捆，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中钦听，密封保存洒试，以免變質。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好朴上。不同批號的試劑不要混用垒棋。保質前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染痪宰，吸取終止液和底物A叼架、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器衣撬。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液乖订。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應充分拍干具练，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水垢粮。
7． 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子恐氓。底物B對光敏感抬奠，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸叛剩，有毒蚓绞。實驗完成后應立即讀取OD值泉疆。
8． 加入試劑的順序應*，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣雌吱。
9． 按照說明書中標明的時間滑攘、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集盼蝴、處理及保存方法
1超璧、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管卖织。收集血液后嘴缓，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2萤晴、 血漿-----EDTA吐句、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測店读。1000×g離心30分鐘去除顆粒嗦枢。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物屯断。
4文虏、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘殖演，取上清液
5氧秘、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存剃氧，避免反復冷凍敏储。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒朋鞍，檢測前先離心或過濾已添。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍滥酥。

試劑的準備
1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備鹰觅，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻棍丽。稀釋比例按下表中進行：
800 ng/ml (6號標準品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul田蝠。
400 ng/ml (5號標準品) 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
200 ng/ml (4號標準品) 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
100 ng/ml (3號標準品) 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50 ng/ml (2號標準品) 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25 ng/ml (1號標準品) 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液(50×)的稀釋：蒸餾水50倍稀釋慈翔。

操作步驟
1． 使用前权塑，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫因镊，以免加樣時加入大量的氣泡托茅，產(chǎn)生加樣上的誤差武慨。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔层焚。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定行掰，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內岸腔。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔坪江、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體脑溢。蓋上膜板僵朗，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時焚志。
4． 甩去孔內液體衣迷，每孔加滿洗滌液畏鼓，振蕩30秒酱酬，甩去洗滌液，用吸水紙拍干云矫。重復此操作3次膳沽。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次让禀。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP挑社，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘巡揍。
6． 甩去孔內液體痛阻，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒奸桃，甩去洗滌液音拢，用吸水紙拍干。重復此操作3次葬陡。如果用洗板機洗滌丈蛇，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A阁巨、B各50ul抬宽，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘岸寿。避免光照硝僻。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液践斟，加入終止液后應立即測定結果毕沫。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值悍蔫。

建議使用的實驗方案
 標準品濃度(ng/ml)
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 100 100 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結果橱奶。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品盯桦。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990渤刃。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應拥峦。
3. 重復性：板內、板間變異系數(shù)均小于10%卖子。

結 果 判 斷 與 分 析
1略号、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(Y)洋闽，相應的AGEs標準品濃度為橫坐標(X)玄柠，做得相應的曲線，樣品的AGEs含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度诫舅。

3羽利、檢測值范圍：0-800ng/ml

4、敏感度： 1.0 ng/ml