本試劑僅供研究使用

試驗(yàn)原理：
試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知AGEs濃度的標(biāo)準(zhǔn)品川队、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育系枪。洗滌后雀哨，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌私爷，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物雾棺，然后加入底物A、B咸婿，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色谋扼。顏色的深淺和樣品中濃度呈比例關(guān)系棒嚼。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標(biāo)板 1塊板(96T) 半塊板(48T) 即用型
塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：800ng/ml 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按說明書進(jìn)行稀稀
空白對(duì)照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型
生物素標(biāo)記的抗AGEs抗體 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型
洗滌緩沖液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml) 按說明書進(jìn)行稀釋
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
標(biāo)本稀釋液 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml) 即用型

自備材料
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul咐准、10ul啃掠、50ul、100ul消李、200键梆、500ul蝉橘、1000ul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等畦未。

安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A润邑、B。一旦接觸到這些液體保铐，請(qǐng)盡快用水沖洗哄谆。
2． 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品季春。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份洗搂。

操作注意事項(xiàng)
1． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫载弄。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄耘拇，不可保存。
2． 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中宇攻，密封保存惫叛，以免變質(zhì)。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好尺碰。不同批號(hào)的試劑不要混用挣棕。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染亲桥，吸取終止液和底物A洛心、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器题篷。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液词身。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干木砾，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水农灯。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子瘸劳。底物B對(duì)光敏感品扯，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸妖恨，有毒捻钢。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應(yīng)*足沥，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣稻续。
9． 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

樣品收集滔菠、處理及保存方法
1逮碾、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管批斯。收集血液后辞槐，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2剩蟀、 血漿-----EDTA催蝗、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)育特。1000×g離心30分鐘去除顆粒丙号。
3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物缰冤。
4犬缨、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘棉浸，取上清液
5怀薛、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存迷郑，避免反復(fù)冷凍枝恋。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒嗡害，檢測(cè)前先離心或過濾焚碌。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍卑竹。

試劑的準(zhǔn)備
1． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備散氧，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻砾漓。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
800 ng/ml (6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul睬嘿。
400 ng/ml (5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
200 ng/ml (4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100 ng/ml (3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 ng/ml (2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 ng/ml (1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品) 100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 ng/ml (空白對(duì)照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液(50×)的稀釋：蒸餾水50倍稀釋闭榛。

操作步驟
1． 使用前盒器，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫衍肥，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡攻睬，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2． 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)呆淑。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔汇径。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔罗卿。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)史隆。
3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)曼验。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體泌射。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻鬓照，37℃溫育1小時(shí)熔酷。
4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液豺裆，振蕩30秒拒秘，甩去洗滌液，用吸水紙拍干臭猜。重復(fù)此操作3次躺酒。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次蔑歌。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP羹应，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘次屠。
6． 甩去孔內(nèi)液體脆逊，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒拇蟋，甩去洗滌液棒鞍，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次竹恃。如果用洗板機(jī)洗滌截巢，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A肘勾、B各50ul呻蚪，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘箫废。避免光照础姚。
8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液譬功，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果填恬。
9． 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案
 標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 100 100 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限
6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的奋隶，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到精確的結(jié)果擂送。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990嘹吨。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)搬味。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%蟀拷。

結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1碰纬、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y)问芬，相應(yīng)的AGEs標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)悦析，做得相應(yīng)的曲線，樣品的AGEs含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度此衅。

3强戴、檢測(cè)值范圍：0-800ng/ml

4、敏感度： 1.0 ng/ml