本試劑僅供研究使用

試驗原理：
試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知AGEs濃度的標準品踢京、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測誉碴。先將和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后瓣距，加入親和素標記過的HRP黔帕。再經(jīng)過溫育和洗滌代咸，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A成黄、B呐芥，和酶結合物同時作用。產(chǎn)生顏色奋岁。顏色的深淺和樣品中濃度呈比例關系思瘟。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標板 1塊板(96T) 半塊板(48T) 即用型
塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型
標準品：800ng/ml 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按說明書進行稀稀
空白對照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型
標準品稀釋緩沖液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型
生物素標記的抗AGEs抗體 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型
洗滌緩沖液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml) 按說明書進行稀釋
底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
終止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型
標本稀釋液 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml) 即用型

自備材料
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul槽邮、10ul耻胖、50ul、100ul调捍、200肌顾、500ul、1000ul吃它。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等冕盅。

安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B锐洞。一旦接觸到這些液體堡酗，請盡快用水沖洗。
2． 實驗中不要吃喝窜交、抽煙或使用化妝品斜兽。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
1． 試劑應按標簽說明書儲存羽址，使用前恢復到室溫帕恩。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存剩失。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中屈尼，密封保存，以免變質(zhì)拴孤。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好脾歧。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用演熟。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染鞭执，吸取終止液和底物A、B液時芒粹，避免使用帶金屬部分的加樣器兄纺。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應充分拍干估脆，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水钦奋。
7． 底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子疙赠。底物B對光敏感付材，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸鼠废，有毒旺民。實驗完成后應立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應*牙茅，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標明的時間肺致、加液的量及順序進行溫育操作指锉。

樣品收集、處理及保存方法
1哈涣、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激吹对。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后勺处，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離暮戏。
2、 血漿-----EDTA痪酸、檸檬酸鹽垃散、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒授嘀。
3物咳、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4蹄皱、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎览闰。1000×g離心10分鐘，取上清液
5巷折、 保存------如果樣品不立即使用压鉴，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍锻拘。盡可能的不要使用溶血或高血脂血油吭。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾逊拍。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍上鞠。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存芍阎。稀釋前將標準品振蕩混勻世曾。稀釋比例按下表中進行：
800 ng/ml (6號標準品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400 ng/ml (5號標準品) 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
200 ng/ml (4號標準品) 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
100 ng/ml (3號標準品) 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50 ng/ml (2號標準品) 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25 ng/ml (1號標準品) 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul冈瞪。

2． 洗滌緩沖液(50×)的稀釋：蒸餾水50倍稀釋踏旷。

操作步驟
1． 使用前，將所有試劑充分混勻找仙。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫糜谒，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差亲敷。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)狸岁。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定卒割，能使用復孔的盡量做復孔泛滔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內(nèi)。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔堂憔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)寡花。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板奥猎，輕輕振蕩混勻昼钻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內(nèi)液體封寞，每孔加滿洗滌液然评，振蕩30秒，甩去洗滌液钥星，用吸水紙拍干沾瓦。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌谦炒，洗滌次數(shù)增加一次贯莺。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻宁改，37℃溫育30分鐘缕探。
6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液还蹲，振蕩30秒爹耗，甩去洗滌液，用吸水紙拍干谜喊。重復此操作3次劣秦。如果用洗板機洗滌王菲，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A蔼邓、B各50ul羽矮，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘侨懈。避免光照痪蚤。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液凄系，加入終止液后應立即測定結果穴肄。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案
 標準品濃度(ng/ml)
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 100 100 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限
6號標準品以上的結果為非線性的量票，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結果人度。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性来讯。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990焚趴。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內(nèi)舱污、板間變異系數(shù)均小于10%。

結 果 判 斷 與 分 析
1弥虐、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2扩灯、以吸光度OD值為縱坐標(Y)，相應的AGEs標準品濃度為橫坐標(X)霜瘪，做得相應的曲線珠插，樣品的AGEs含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3颖对、檢測值范圍：0-800ng/ml

4捻撑、敏感度： 1.0 ng/ml