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菌種的原生質(zhì)體融合育種方法

要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類妆艘、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善植康，先必須選取性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種旷太。菌種選育包括根據(jù)菌種的自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及根據(jù)遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和方法利用誘變育種技術(shù)销睁、原生質(zhì)體融合技術(shù)祟勿、基因工程技術(shù)而進(jìn)行的誘變育種、細(xì)胞工程育種累筋、基因工程育種等耀旅。

原生質(zhì)體融合育種

細(xì)胞壁被酶解剝離，剩下的由原生質(zhì)膜包圍的原生質(zhì)部分稱為原生質(zhì)體订淑。原生質(zhì)體融合是通過人工方法枷辫，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生全重組子的過程搁排。原生質(zhì)體融合技術(shù)是繼轉(zhuǎn)化笔房、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等微生物基因重組方式之后，又個(gè)其重要的基因重組技術(shù)占窥。原生質(zhì)體融合技術(shù)的運(yùn)用学虑，使細(xì)胞間基因重組的頻率大大提高，基因重組親本的選擇范圍也得以擴(kuò)大唆海，可以在不同種欲炉、屬、科赞季，甚至更遠(yuǎn)緣的微生物之間進(jìn)行愧捕。這為利用基因重組技術(shù)培育更多更優(yōu)良的生產(chǎn)菌種提供了可能。原生質(zhì)體融合技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌申钩、放線菌次绘、霉菌和酵母菌的育種。

微生物原生質(zhì)體融合分為以下五大步驟：

1.選擇親株

為了能明確檢測到融合后產(chǎn)生的重組子并計(jì)算重組頻率撒遣，參與融合的親株般都需要帶有可以識(shí)別的遺傳標(biāo)記邮偎。常用營養(yǎng)缺陷型或抗藥性作為標(biāo)記，也可以采用熱致死义黎、孢子顏色禾进、菌落形態(tài)等作為標(biāo)記。在進(jìn)行原生質(zhì)體融合前廉涕，應(yīng)先測定菌株各遺傳標(biāo)記的穩(wěn)定性泻云，如果自發(fā)回復(fù)突變的頻率過高，則不宜采用狐蜕。

2.原生質(zhì)體制備

為了制備原生質(zhì)體壶愤，去除細(xì)胞壁是關(guān)鍵淑倾。去壁的方法有三種：機(jī)械法、非酶分離法和酶解法涮饱。般都采用酶解法去壁绸廉，根據(jù)微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同，需分別采用不同的酶常择，如姨痊、纖維素酶、蝸牛酶等笆赤。

放線菌肽聚糖革蘭氏陰性菌肽聚糖和脂多糖和EDTA霉菌纖維素和幾丁質(zhì)纖維素酶或真菌中分離的溶壁酶酵母菌葡聚糖和幾丁質(zhì)蝸牛酶

在菌體生長的培養(yǎng)基中添加购狈，可以使菌體較容易被酶解，滲入細(xì)胞壁肽聚糖中代替D的位置粮唯，影響細(xì)胞壁中各組分間的交聯(lián)度杂猾。在菌體生長階段添加蔗糖，擾亂菌體的代謝浇找，也能提高細(xì)胞壁對(duì)的敏感性签子。因?yàn)槟芨蓴_肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽作用，使多糖部分不能交聯(lián)搭为，從而影響肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成缺西，所以，在菌體生長對(duì)數(shù)期加入適量馒胆，能使細(xì)胞對(duì)更敏感缨称。

3.原生質(zhì)體融合

聚乙二醇（pEG）能有效地促進(jìn)原生質(zhì)體融合。其助融作用可能與下列過程有關(guān)：開始時(shí)祝迂，由于強(qiáng)烈的脫水而使原生質(zhì)體粘在起睦尽，并形成聚合體。原生質(zhì)體收縮并高度變形型雳，使原生質(zhì)體之間的接觸面增大当凡。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，加大了細(xì)胞膜的流動(dòng)性四啰，膜內(nèi)的蛋白質(zhì)和糖蛋白相互作用和混合，使緊密接觸的原生質(zhì)體相互融合粗恢。pEG對(duì)細(xì)胞尤其是原生質(zhì)體也有定的毒害作用柑晒，因此，作用的時(shí)間般不宜過長眷射。pEG有不同的聚合度匙赞。在細(xì)菌原生質(zhì)體融合中，多采用高相對(duì)分子質(zhì)量的pEG（如pEG6000）只逐；對(duì)放線菌則可采用各種相對(duì)分子質(zhì)量的pEG季距。pEG的使用濃度范圍般在30%~50%，但隨著微生物種類的不同而異。此外蒿蛆，物理融合劑抄娜，如電場和激光也能有效促進(jìn)融合。

4.融合體再生

融合體再生就是使原生質(zhì)體融合體重新長出細(xì)胞壁毙纫，恢復(fù)完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)砂彻。能再生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體只占總量的部分。細(xì)菌般再生率為3%~10%港排；真菌再生率般在20%~80%搪狗；鏈霉菌再生率高可達(dá)50%。若要獲得較高的再生率筑背，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免因強(qiáng)力動(dòng)作而使原生質(zhì)體破裂跛究。在將原生質(zhì)體懸液涂布在再生培養(yǎng)基平板上前，宜預(yù)先去除培養(yǎng)基表面的冷凝水寸靶。涂布時(shí)重虑，原生質(zhì)體懸液的濃度不宜過高。因?yàn)槿粲袣埓娴木w存在堪侯，它們將會(huì)在再生培養(yǎng)基中長成菌落嚎尤，并抑制周圍原生質(zhì)體的再生。另外伍宦，菌齡芽死、再生時(shí)的溫度、用量和溶壁時(shí)間等因素都會(huì)影響原生質(zhì)體融合體的再生次洼。

5.篩選優(yōu)良性狀融合重組子

重組子的檢出方法有三種：直接法关贵、間接法和鈍化選擇法。直接法是將融合液涂布在不補(bǔ)充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養(yǎng)基平板上卖毁，直接篩選出原養(yǎng)型重組子揖曾。間接法是把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落亥啦，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上炭剪，檢出重組子。鈍化選擇法是在融合前使親本中的方（野生型）原生質(zhì)體代謝途徑中的某些酶鈍化不能再生翔脱，再與另方（雙缺陷型）原生質(zhì)體融合奴拦，融合體在基本培養(yǎng)基上分離。

以上獲得的還僅僅是融合重組子匀铸，尚需進(jìn)行生理生化測定及生產(chǎn)性能的測定天库，以確定是否符合育種的要求。