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瓊脂糖膠和PAGE膠制備方法
閱讀：2177 發(fā)布時間：2010-1-20 一窟蝌、瓊脂糖凝膠的特點
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖预铁，主要由瓊脂糖（agarose询时，約占80％）及瓊脂膠（agaropectin）組成谎雷。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷捷夜，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖楚榕，由于這些基團帶有電荷商贾，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果吨拗。因此满哪，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下劝篷。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單哨鸭，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳娇妓。
（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻像鸡，含水量大（約占98％~99％），近似自由電泳哈恰，樣品擴散較自由電流只估，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰着绷，分辨率高蛔钙，重復(fù)性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收荠医，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定吁脱。
（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫彰莲，便于定量測定灿躏。制成干膜可長期保存。
目前聂挚，常用瓊脂糖作為電泳支持物唐耿，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合菱泻，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系昵斤，由于建立了超微量技術(shù)肉扁，0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離困邪、鑒定核酸勃谎，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等业馒。由于這種方法操作方便慷境，設(shè)備簡單，需樣品量少蛾趣，分辨能力高冗懦，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一爽冕。
二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型披蕉，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系颈畸。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中没讲，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比眯娱，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小爬凑。但是當DNA分子大小超過20kb時徙缴，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小嘁信，因此于样，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值吱抚。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示百宇，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
| 瓊脂糖濃度/％ | 0.3 | 0.6 | 0.7 | 0.9 | 1.2 | 1.5 | 2.0 |
| 線狀DNA大小/kb | 60－5 | 20－1 | 10－0.8 | 7－0.5 | 6－0.4 | 4－0.2 | 3－0.1 |
不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：供價閉環(huán)DNA（covalently closed circular水搀，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時衙到，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中沟智，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0）贱避，由此可見啡洁，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時疙汁，也受到電流強度蕊肖、緩沖液離子強度等的影響。
3语哺、電泳方法
（1）凝膠類型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）逐豆。水平型電泳時，凝膠板*浸泡在電極緩沖液下1-2mm忽仗，故又稱為潛水式范颠。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便棒假，電泳槽簡單溯职，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板帽哑，節(jié)約凝膠谜酒，因而較受歡迎叹俏。
（2）緩沖液系統(tǒng)
缺少離子時，電流太小甚带，DNA遷移慢她肯；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱鹰贵，嚴重時晴氨，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA）碉输，Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等籽前，濃度約為50mmol/L（pH7.5~7.8）。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液敷钾，臨用時稀釋到所需倍數(shù)枝哄。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力絮增，因此更常用德籍。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點菜缭，室溫下貯存5×溶液消耸，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
以稀釋的電極緩沖液為溶劑宪郑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠租既，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子袁垄，自然冷卻宿拔。
（4）樣品配制與加樣
DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25％溴酚藍或其他指示染料鼓临，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油视甩，以增加其比重，使樣品集中角黍。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶共螺，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明情竹，在低濃度、低電壓下匀哄，分離效果較好秦效。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比涎嚼。但是阱州，在電場強度增加時挑秉，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高苔货，電泳分辨率反而下降犀概，為了獲得電泳分離DNA片段的zui大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm夜惭。
電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響姻灶。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低于0.5％時诈茧，為增加凝膠硬度铡畜，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
常用熒光染料溴乙錠（EB）染色粗线，在紫外光下觀察DNA條帶那梭，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片蚂霎，并進行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析竣恃。
SDS-PAGE膠制備
SDS-PAGE是對蛋白質(zhì)進行量化，比較及特性鑒定的一種經(jīng)濟贷挠、快速筝驱、而且可重復(fù)的方法。該法是依據(jù)混合蛋白的分子量不同來進行分離的棠镇。
SDS是一種去垢劑焊轴，可與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)亭郑，并使其廣泛存在于一個廣泛均一的溶液中相梭。SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。在樣品介質(zhì)和凝膠中加入強還原劑和去污劑后媳谁，電荷因素可被忽略涂滴。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。
二. 試劑和器材：
試劑：1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（pH6.8）,5ml 50％甘油晴音，2ml 10％的SDS柔纵，0.5ml巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍锤躁，0.9ml蒸餾水搁料。可在4℃保存數(shù)周系羞，或在－20℃保存數(shù)月郭计。
2. 凝膠貯液：在通風(fēng)櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g昭伸，加重蒸水溶解后梧乘，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中庐杨，4℃保存选调，一般可放置1個月。
3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g 律愉，加1mol/L HCl 48ml臭呀，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH8.9磷砌，定容至100ml币遮， 4℃保存。
4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g 粒删，加1mol/L HCl 48ml躏印，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH6.7屁诬，定容至100ml笋俭， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）
7. pH8.3 Tris-*電極緩沖液：稱取Tris 6.0g给惠，*28.8g沦恩，加蒸餾水約900ml，調(diào)pH8.3后拌喳，用蒸餾水定容至1000ml拒惯。置4℃保存，臨用前稀釋10倍渤早。
8. 考馬斯亮藍G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍G250职车，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過氯酸鹊杖，zui后補足水到250ml悴灵，攪拌1小時，小孔濾紙過濾骂蓖。
器材：電泳儀积瞒，電泳槽，水浴鍋登下，搖床茫孔。
三. 實驗操作；
（一）樣品制備
將蛋白質(zhì)樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個Eppendorf管中混合被芳。放入100℃加熱5－10min银酬，取上清點樣嘲更。
（二）分離膠及濃縮膠的制備1 將玻璃板、樣品梳揩瞪、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH2O沖洗數(shù)次咳讲，再用乙醇擦拭慕怀，晾干；
2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer灸颜，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說明書提示裝好玻璃板阐祭；
3 按如下體積配制10％分離膠8.0 ml，混勻拇从；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板間灌制分離膠搬挡，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合赠恭；
5 按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml术拇，混勻；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 將上層重蒸水傾去棱歹，濾紙吸干祠烁，灌制濃縮膠，插入樣品梳馁梁；
7 裝好電泳系統(tǒng)饰吕，加入電極緩沖液，上樣20 μl;
8 穩(wěn)壓200V隔心，溴酚藍剛跑出分離膠時白群，停止電泳，約需45 min～1hr.
9 卸下膠板硬霍，剝離膠放入染色液中帜慢，室溫染色1～2 hr；加入脫色液须尚，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸崖堤；45 ml乙醇；45 ml蒸餾水）至*脫凈耐床。