時(shí)至今日，代謝組學(xué)已經(jīng)成為生物組學(xué)研究領(lǐng)域的重要組成部分口迟。通過檢測生物樣本中小分子代謝物岗命，使得我們對于各種生物體的代謝系統(tǒng)以及代謝組與基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組在生命的分子過程中的相互作用有了深入的理解保蒲。
高分辨質(zhì)譜(HRMS)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析是當(dāng)前表征生物樣本中小分子代謝物的主要手段之一品救。然而，由于生物體內(nèi)代謝物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜贼卿、多樣他景，實(shí)現(xiàn)生物樣本中小分子代謝物的全覆蓋鑒定和準(zhǔn)確定量分析仍然是本領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。其中彬率，大極性托足、離子代謝物的檢測尤其受到關(guān)注。離子色譜主要使用離子交換的分離原理署隔，和常規(guī)液相色譜主要基于疏水吸附的反相分離原理形成互補(bǔ)妒穷，可以很好分離常規(guī)液相色譜難以分離的強(qiáng)極性可電離代謝物瓦统。即使是基于親水相互作用的HILIC色譜可以分離強(qiáng)極性代謝物，但也難以分離強(qiáng)電離代謝物橡舟。離子型物質(zhì)分離金矛，必須使用離子型物質(zhì)做為流動相，但離子型物質(zhì)本身與質(zhì)譜的最佳檢測環(huán)境并不兼容勺届。因此驶俊，我們需要安裝膜抑制器作為一個(gè)持續(xù)工作的脫鹽裝置，通過膜轉(zhuǎn)移的原理去除對位離子涮因，使酸堿變成純水，從而實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜兼容伺绽。
圖1 不同極性化合物需要不同的色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行分析
分離度
核苷酸养泡、糖類等在代謝通路中存在多個(gè)同分異構(gòu)體，這些同分異構(gòu)體在細(xì)胞代謝中承擔(dān)著不同且重要的功能奈应。因此澜掩，我們不僅需要檢出相關(guān)化合物，更需要將這些同分異構(gòu)體代謝物進(jìn)行有效色譜分離杖挣。圖2展示了IC與HILIC分析21種極性代謝物對照品的分離效果肩榕。大部分化合物在HILIC色譜柱上出峰情況良好，然而惩妇，對于磷酸糖類以及順式株汉、反式丁烯二酸等同分異構(gòu)體代謝物來說，HILIC的分離效果明顯差于IC撤掀。在細(xì)胞樣本的測試中狱槽，不同色譜條件下對m/z 259.0224進(jìn)行提取離子流(圖3)。IC色譜條件下檢測到了11個(gè)色譜峰拂谆，檢出數(shù)量和強(qiáng)度顯著高于其他色譜條件屿帕。根據(jù)精確質(zhì)荷比信息，推測該系列化合物的元素組成為C6H13O9P姓纲，在代謝物數(shù)據(jù)庫中檢索盗晓，有至少33個(gè)代謝物符合該元素組成，其中包括葡萄糖愕啰、果糖津霜、半乳糖、甘露糖等多種重要的磷酸單糖温盅。
圖2 21種代謝物對照品使用IC和HILIC進(jìn)行分離的峰形比較
圖 3 細(xì)胞樣本中磷酸單糖化合物在不同色譜條件下的色譜分離比較
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靈敏度
在濃度為60 ppb(0.2-0.7 μmol/L)的情況下殃烤，使用IC-MS分析極性代謝物對照品。(圖2)這些代謝物的信噪比(S/N)約為1000篡话，相當(dāng)于柱上量0.5-2.5 pmol情誊。其中一半的代謝物可在非常低的濃度下(60 ppt水孩，相當(dāng)于柱上樣量3.4 fmol以下)被檢測到，信噪比在3到20之間琐驴。最低檢測限(LODs)的濃度范圍為0.04-0.5 nmol/L(見表1)俘种，展示了超高靈敏度。
表1 21種代謝物在cap IC-Orbitrap平臺的最低檢測限（LODs）
重現(xiàn)性
在連續(xù)6天的日間穩(wěn)定性考察中绝淡，每天平行測試6針對照品混標(biāo)(600 ppb)宙刘，所有化合物的保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度RSD均小于8%，完全適應(yīng)代謝組學(xué)分析要求牢酵。(圖4)在實(shí)際細(xì)胞樣本測試中悬包，6種細(xì)胞中的11種磷酸單糖以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)馬尿酸-d5的色譜保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度同樣表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性(n=3)。
圖4 日間重現(xiàn)性考察(n=6)
圖5 不同細(xì)胞樣本中11種磷酸單糖的離子流圖
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代謝通路覆蓋度
采用IC-MS的方法進(jìn)行細(xì)胞代謝組學(xué)分析馍乙，幾乎完整地覆蓋了糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要代謝物布近。(圖6)通過相關(guān)測試結(jié)果，可以幫助我們有效觀察細(xì)胞能量代謝丝格、代謝穩(wěn)態(tài)的變化撑瞧。
圖6 糖酵解、TCA代謝途徑及細(xì)胞樣本中相關(guān)代謝物含量測試結(jié)果(點(diǎn)擊查看大圖)
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小結(jié)
離子抑制技術(shù)的發(fā)展显蝌，特別是連續(xù)電解離子抑制技術(shù)预伺，使得離子交換色譜與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合成為可能，這種組合帶來了新的分析機(jī)會惨浩。IC-MS平臺技術(shù)的商業(yè)化推廣使得越來越多的實(shí)驗(yàn)室探索了IC-MS的新應(yīng)用領(lǐng)域早斯，并揭示了超出傳統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域的成功案例。例如赫窄，除了對無機(jī)離子的分析外茄溢，有機(jī)和生物極性和離子分析物已經(jīng)成功地在廣泛的環(huán)境和生物樣品類型中進(jìn)行了有針對性的分析和表征。使用離子抑制的IC-MS分析具有產(chǎn)生洗脫劑和極性選擇性的組合特性椭集，減少了有效基質(zhì)復(fù)雜性蝉狭，降低了質(zhì)譜檢測中可能導(dǎo)致分析干擾的基質(zhì)效應(yīng)和色譜擁擠。分析物通常已經(jīng)處于離子形式咳龄；因此撞恰，通過質(zhì)譜檢測實(shí)現(xiàn)高靈敏度分析可以最大程度地減少離子抑制。相比之下迎反，用于離子和高極性分析物表征的其他色譜方法(如RP-MS审服、HILIC-MS、GC-MS和IP-MS)可能抑制分析物的離子特性(使用低質(zhì)子溶劑旷似、衍生化等)烤惊，以便提供有效的分析條件，這可能導(dǎo)致覆蓋范圍和信號抑制的偏差吁朦∑馐遥總之渡贾，IC-MS已經(jīng)成為一種有效的互補(bǔ)(或替代)分析工具，表現(xiàn)出高水平的平臺穩(wěn)定性雄右、保留時(shí)間重現(xiàn)性空骚、靈敏度和低檢測限。迄今為止擂仍，大多數(shù)應(yīng)用集中在法醫(yī)科學(xué)囤屹、環(huán)境科學(xué)、技術(shù)和制造業(yè)以及食品化學(xué)領(lǐng)域逢渔。然而肋坚，在制藥科學(xué)、臨床化學(xué)肃廓、診斷學(xué)智厌、微生物學(xué)、代謝組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多屏糊，這些領(lǐng)域還有許多重要的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用的空間(圖5)吓缴。無論是在復(fù)雜基質(zhì)中還是在高極性或離子分析物中寇淑，IC-MS都有新的應(yīng)用空間唯诞。展望未來，我們認(rèn)為IC-MS的未來應(yīng)用將包括對復(fù)雜生物和環(huán)境系統(tǒng)和過程的深入研究兆婆，宿主-病原體關(guān)系植嚼，微生物組代謝，植物與土壤化學(xué)之間的關(guān)系婿哥，藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)钾非，以及與疾病的診斷、預(yù)后和病因相關(guān)的生物標(biāo)志物研究酣矮。從傳統(tǒng)意義上講巨均，這些領(lǐng)域在分析上具有特殊的挑戰(zhàn)性，特別是在使用非靶向方法時(shí)颅挟；因此测捎，IC-MS在發(fā)現(xiàn)導(dǎo)向和有針對性應(yīng)用中有潛力發(fā)揮重要作用。
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